網站地圖 原創論文網,覆蓋經濟,法律,醫學,建筑,藝術等800余專業,提供60萬篇論文資料免費參考
主要服務:論文發表、論文修改服務,覆蓋專業有:經濟、法律、體育、建筑、土木、管理、英語、藝術、計算機、生物、通訊、社會、文學、農業、企業

曼斯布莱顿西服档次:豬乙型腦炎病毒疫苗種類與研發情況

來源:原創論文網 添加時間:2019-09-04

布莱顿西服 www.ybzmtt.com.cn   摘    要: 豬乙型腦炎 (Japanese encephalitis, JE) 是由乙型腦炎病毒 (JEV) 引起的一種經蚊蟲傳播的人畜共患病, 且是嚴重威脅人畜健康的一種中樞神經系統的急性傳染病。豬是JEV的重要儲存宿主和擴增宿主, 同時也是乙型腦炎的主要傳染源, 可引起母豬繁殖障礙和公豬睪丸炎。人是JEV的終末宿主, 特別是兒童, 感染發病后, 死亡率可達25%。目前, 仍無有效藥物治療乙型腦炎感染, 而其流行區域的擴大及其優勢基因型的改變為JEV防控策略帶來了新的挑戰。近年來, 隨著基因工程和蛋白質工程的發展, 以及對病毒分子結構和功能的深入研究, 一些新技術新手段被應用到JEV疫苗研發中, 基因工程亞單位疫苗、病毒樣顆粒疫苗、嵌合病毒減毒活疫苗、多表位疫苗、DNA疫苗等應運而生。在疫苗制備過程中, 培養工藝的優化、病毒抗原的純化、新型佐劑和耐熱?;ぜ戀撓τ玫壬ひ盞奶嶸唄? 為保障JEV疫苗的質量提供了新方向。文章簡述了豬JEV疫苗的使用現狀及研發進展, 旨在為研制更安全、有效的豬JEV疫苗提供參考依據。

  關鍵詞: 乙型腦炎病毒; 滅活疫苗; 活疫苗; 豬; 病毒樣顆粒; 基因工程疫苗;

  Abstract: Japanese encephalitis (JE) is an acute zoonosis, and has the characteristic of infectious diseases in the central neural system (CNS) , which caused by Japanese encephalitis virus (JEV) and transmitted by mosquitoes.The pigs are important storage and increase host of JEV, and it was main origin of infection.JEV can cause pregnant sow abortion and boar testitis.Humans are the terminal host of JEV, especially children, and the mortality rate can reach 25% after infection.There are still no effective drugs for JEV.The expansions of the epidemic area of JE and the changes of dominant genotypes have brought new challenges to the prevention and control strategies of JEV.In recent years, with the development of genetic and protein engineering, as well as the researches on the molecular structure and function of viruses, more and more new technologies and methods have been applied to the researches of vaccine for JEV.As a result, genetically engineered subunit vaccine, virus-like particle vaccine, chimeric virus attenuated live vaccine, polypeptide vaccine and DNA vaccine have emerged at the historic moment.In the process of vaccine preparation, the production process of optimizing the culture mode, purifying virus antigen, applying new adjuvant and heat resistant protective agents are expected to provide a new research direction for improving the quality of JEV vaccine.The present situation and development of swine encephalitis vaccine strain were reviewed in this paper to provide references for the development of safer and more effective vaccines against JEV.

  Keyword: Japanese encephalitis virus (JEV) ; inactivated vaccine; live-attenuated vaccine; swine; virus-like particles; genetically engineered vaccine;

  豬乙型腦炎 (Japanese encephalitis, JE) 是由黃病毒科 (Flaviridae) 黃病毒屬 (Flavivirus) 乙型腦炎病毒 (Japanese encephalitis virus, JEV) 引起的可經蚊蟲傳播的中樞神經系統感染急性人畜共患傳染病[1]。JEV在蚊子和脊椎動物宿主 (特別是豬) 中呈地方性傳播。JEV感染可引起妊娠母豬流產、死胎、木乃伊胎, 公豬睪丸炎等, 人感染后 (尤其是兒童) 可引發嚴重的中樞神經系統疾病甚至是急性致死腦炎, 死亡率可達25%??馕檬荍EV主要的傳播媒介, 豬是其主要的儲存宿主、擴增宿主和傳染源, 通??尚緯?ldquo;豬-蚊-人”的循環傳播模式。由于目前尚無治療乙型腦炎的有效辦法, 接種疫苗仍是控制JEV的主要方式, 而豬在JEV的傳播中發揮著重要的作用, 因此研發有效的豬用JEV疫苗是切斷其向人傳播的有效策略[2]。作者對豬乙型腦炎疫苗毒株的使用現狀、研發進展等方面進行了分析總結, 以期為研制更安全、有效的豬JEV疫苗提供參考依據。

  1、 國內外JEV疫苗毒株使用現狀

  JEV共有5個基因型:基因Ⅰ~Ⅴ型, 分布具有區域性。印度尼西亞、馬來西亞地區5個基因型都有分布;澳大利亞、新幾內亞地區主要存在基因Ⅰ、Ⅱ型;中國臺灣、菲律賓地區存在基因Ⅱ、Ⅲ型;泰國、柬埔寨、越南地區存在基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型;日本、韓國、中國存在基因Ⅰ、Ⅲ型;印度、斯里蘭卡、尼泊爾地區存在基因Ⅲ型;東亞和南亞的亞洲大陸上存在基因Ⅴ型。目前所有可用的疫苗毒株主要有:Nakayama株、SA14-14-2株、Beijing-3 (P3) 、Beijing-1 (P1) 株等, 均為JEV基因Ⅲ型[3]。

豬乙型腦炎病毒疫苗種類與研發情況

  Nakayama株 (中山株) 1935年于日本分離自一名患者腦組織中[3], 在鼠腦中連續傳代, 在小鼠模型上可提供對多個JEV的攻毒?;? 是生產鼠腦滅活疫苗的主要疫苗株。Beijing-1 (P1) 株1949年于北京分離于病人腦組織中, 較Nakayama株可產生更廣泛的抗體反應。Beijing-3 (P3) 株1949年分離于患腦炎死者的腦組織中, 具有對小鼠毒力強, 免疫原性廣, 可產生更廣泛的抗體反應等特點。SA14-14-2株1954年于西安分離自三帶喙庫蚊幼蟲體內, 將其第11代鼠腦病毒在原代地鼠腎細胞連續傳100代, 經多次蝕斑克隆純化, 獲得1株在小鼠腦內傳5代的穩定株5-3株, 后將該毒株進一步通過乳鼠皮下傳代5次, 再克隆2次后得到, 具有對小鼠無致病力, 基因型高度穩定, 免疫原性好等特點。

  2、 JEV疫苗種類

  目前, 已有4種不同類型的JEV疫苗:鼠腦滅活疫苗、細胞培養滅活疫苗、細胞培養減毒活疫苗和基因工程減毒活疫苗。獸用乙腦疫苗主要為鼠腦滅活疫苗和地鼠腎細胞乙腦活疫苗。

  2.1、 鼠腦滅活疫苗

  JEV滅活疫苗在20世紀30年代開始研制, 首個批準的鼠JEV滅活疫苗是日本Biken公司生產的JE-VAX?[4], 該疫苗使用Nakayama毒株, 甲醛滅活。

  由感染JEV P1株系的鼠腦組織制備的滅活疫苗抗原產量高, 可誘導中和抗體應答, 而后在疫苗生產中由P1株取代了Nakayama株。現在除日本外其他亞洲國家, 如印度、泰國、韓國、越南也小量生產這種疫苗。但由于該疫苗價格較高, 且時有不良反應發生, 因此未能大規模使用。

  1950~1951年, 中國衛生部北京生物制品研究所研制的鼠腦組織JEV毒株為P1株, 1952~1959年間推廣使用。1968年改用轉瓶培養地鼠腎細胞成致密單層后接種P3株, 37 ℃培養2 d或32 ℃培養3 d, 收獲病毒, 此法生產的疫苗安全性和免疫原性都明顯提高, 因此一直沿用至今。

  2.2、 細胞培養JEV滅活疫苗

  隨著細胞培養技術的發展, 疫苗生產進入了更加可控的階段??悸塹絞竽訨EV滅活疫苗的安全性, 歐洲和日本開始使用細胞培養繁殖JEV。細胞培養JEV滅活疫苗與鼠腦JEV滅活疫苗在毒株、生產工藝和最終產品的配方等方面均存在明顯差異。日本使用P1毒株生產Vero細胞源的JEV滅活疫苗。此外, IC51是一種Vero細胞源、氫氧化鋁為佐劑的乙型腦炎SA14-14-2株滅活疫苗[5], 其是將SA14-14-2株在PDK細胞傳代后又在Vero細胞上傳代若干次, 使其E蛋白基因第138和176位發生突變, 最終得到IC51毒株[6]。IC51疫苗中不含任何明膠或防腐劑等穩定劑。自2009年以來, IC51已在包括美國、歐洲、加拿大、澳大利亞、瑞士和印度在內的許多國家獲得了3個商業許可 (IXIARO、JESPECT和JEEV) 。

  1968年, 中國開始生產原代地鼠腎細胞培養的JEV滅活疫苗 (將P3株接種原代地鼠腎細胞, 收獲的病毒經甲醛滅活制成疫苗) 是1968~2000年間使用的主要JEV疫苗。該疫苗大大降低了過敏反應發生率, 免疫原性和安全性都明顯提高。之后在此滅活疫苗的基礎上增加了純化工藝制備出的原代地鼠腎細胞純化JEV疫苗, 取得了良好效果。1998年, 獲批Vero細胞源的乙型腦炎P3株滅活疫苗是目前國內使用的主要滅活疫苗, 但逐漸被SA14-14-2株弱毒疫苗所取代。

  2.3 、細胞培養JEV減毒活疫苗

  1989年, Yu[7]獲得了JEV SA14-14-2減毒株系, 并以此制備了地鼠腎細胞JEV減毒活疫苗, 在中國獲得許可上市。該疫苗是將JEV SA14-14-2減毒株病毒接種于原代地鼠腎單層細胞, 經培育后收獲病毒液, 加?;ぜ煉掣芍瞥?。WHO疫苗安全顧問委員會對SA14-14-2疫苗的安全性進行評價, 認為其不良反應輕微, 無神經學不良反應。該疫苗對小白鼠、豚鼠和豬免疫1次后可產生較為理想的?;ち蚩固宸從? ?;ばЧ? ?;な奔涑?。JEV SA14-14-2減毒活疫苗已加入國家計劃免疫程序, 對全國兒童進行預防接種。目前SA14-14-2減毒活疫苗是JEV流行國家使用最廣泛的疫苗, 已在尼泊爾、斯里蘭卡、韓國、柬埔寨、老撾、緬甸、泰國和印度獲得疫苗上市許可[8]。

  2.4 、獸用JEV疫苗

  目前, 國內獸用JEV疫苗有鼠腦滅活疫苗和地鼠腎細胞活疫苗兩種。滅活疫苗采用豬JEV HW1株腦內接種小白鼠, 將收獲感染的小白鼠腦組織制成懸液, 經甲醛溶液滅活后, 加油佐劑混合乳化制成。由于使用了鼠腦組織培養, 可導致神經系統不良反應, 因此市場上應用很少?;鉅咼綺捎肑EV SA-14-14-2株接種地鼠腎原代細胞培養, 收獲病毒培養液, 加適宜?;ぜ? 經冷凍真空干燥制成。原代細胞源活疫苗的生產存在批次差異大, 成本高的缺點。

  豬JEV滅活疫苗 (GD株) 是選用豬源GD株, Vero細胞為基質制備的滅活疫苗, 對豬安全, 可刺激小鼠機體產生良好的免疫應答, 對小鼠的?;ぢ矢? 目前該產品正在進行臨床試驗。豬JEV活疫苗 (傳代細胞源, SA14-14-2株) 選擇了一種對豬安全、適宜于乙腦SA14-14-2株增殖的Vero傳代細胞系作為疫苗生產用細胞基質制備, 對豬安全有效。目前該產品已完成臨床試驗。

  3、 JEV疫苗研發進展

  3.1、 基因工程亞單位疫苗

  JEV的結構蛋白為C蛋白、PrM蛋白及E蛋白。C蛋白是JEV的基礎蛋白;M蛋白是病毒誘發?;ば悅庖叩鬧匾煞? 能誘生具有輕度中和作用的抗體;PrM蛋白是M蛋白的前體, 是未成熟病毒體的一部分, 其在病毒出芽過程中發揮重要作用。E蛋白作為JEV最主要結構蛋白, 是JEV的?;ば鑰乖? 具有血凝活性, 并且能刺激機體產生中和抗體, 是體外中和作用的主要靶位點, 也是特異性抗體的作用位點[9]。因此, 利用JEV E、M蛋白研究安全、高效、廉價的新型疫苗防制JEV具有十分重要的意義。

  Zhang等[10]采用果蠅表達系統成功表達了重組JEV E蛋白, 他們將編碼JEV PrM、E蛋白的基因序列克隆到果蠅表達載體pAc5.1/v5-His中, 然后用該重組載體轉染果蠅S2細胞系, 成功構建穩定表達重組JEV E蛋白的細胞系, 用該重組蛋白免疫小鼠能誘導小鼠產生特異性的中和抗體。Hua等[11]成功構建了穩定表達JEV病毒樣顆粒的BJ-ML細胞系, 該細胞系能將JEV病毒樣顆粒分泌到培養液上清中, 抗原表達量高達15~20 μg/mL, 用該抗原免疫小鼠后能產生高滴度的中和抗體, 攻毒后能產生100%的?;? 可作為一種安全有效的JEV亞單位疫苗候選物。

  3.2、 病毒樣顆粒疫苗

  病毒樣顆粒 (VLP) 是由病毒單一或多個結構蛋白自行裝配而成的高度結構化的蛋白質顆粒, 缺乏調節蛋白和感染性核酸, 無復制和感染能力, 保持了病毒抗原蛋白的天然構象, 因而具備激發宿主先天性和適應性免疫反應功能。VLP技術已廣泛用于疫苗的研發與生產中。

  張艷芳等[12]將JEV PrM、E及其信號肽基因片段克隆到穿梭載體AcBacmid中, 構建重組穿梭載體AcBac-prME。Lipofectine介導其轉染Sf9細胞, 獲得重組桿狀病毒Ac-prME。該病毒在Sf9細胞中高效表達, 且形成了病毒樣顆粒。該病毒樣顆粒免疫可使小鼠獲得有效抵抗JEV強毒株攻擊的能力, ?;ぢ矢嘰?00%, 從而為研制基于JEV樣顆粒的亞單位疫苗奠定了基礎。De Wispelaere等[13]將基因Ⅲ型JEV毒株PrM、E蛋白編碼基因插入慢病毒TRIP載體, 構建JEV VLPs, 在小鼠和仔豬模型中能夠高效誘導高滴度的抗JEV中和抗體, 誘導對JEV感染的?;ば蘊逡好庖哂Υ? 此外, 還可誘導針對JEV基因Ⅰ、Ⅲ和Ⅴ型的中和抗體反應。Matsuda等[14]通過合成經過密碼子優化的PrM、E基因成功研制出JEV-Nakayama毒株病毒樣顆粒疫苗 (NVLP) 。用該病毒樣顆粒感染家蠶Bm-N細胞后通過蛋白印跡和熒光檢測法均可檢測到重組JEV Nakayama-BmNPV (JEV-NNPV) 病毒的表達。將該重組體接種蟬蛹, 3 d后蟬蛹勻漿中的NVLP產量達到峰值, 每只蟬蛹大約能生產300~500 μg的E蛋白。此外, NVLP對雞紅細胞具有強烈的血細胞凝集 (HA) 活性。經NVLP免疫后產生的中和抗體能有效的中和JEV Nakayama株、Beijing-1株和MUAR株。因此, 該疫苗可用于控制亞洲國家JEV, 且具有成本低、免疫效果好的優點。目前, JEV基因Ⅰ型已經取代基因Ⅲ型成為優勢基因型, Fan等[15]開發了一種可表達JEV基因Ⅰ型病毒樣顆粒的系統, 能穩定表達并連續分泌基因Ⅰ型VLP, 形成均勻的空顆粒。對其免疫原性和?;ち釁蘭鄯⑾? 該病毒樣顆粒與JEV基因Ⅰ型病毒有相似的抗原活性, 該病毒樣顆粒能對JEV基因Ⅰ~Ⅲ型均有交叉?;ぷ饔?。接種該病毒樣顆粒后用JEV基因Ⅰ、Ⅲ型攻毒, 未出現發熱和病毒血癥現象, 并且在腦淋巴結和扁桃體中均未檢測到病毒核酸, 表明該病毒樣顆粒能有效防止豬群JEV基因Ⅰ、Ⅲ型病毒的感染。

  3.3 、嵌合病毒減毒活疫苗

  嵌合病毒可大幅度降低被替換結構基因的病毒毒性, 是JEV疫苗發展的一個新方向。研究表明, 黃熱病毒減毒株YFV17D是一種安全有效的嵌合病毒載體, 單次免疫后即能產生高滴度的中和抗體[16]。Appaiahgari等[17]將JEV SA14-14-2株PrM和E蛋白替換黃熱病毒17D株cDNA的對應位置, 保留黃熱病毒17D株的C蛋白、非結構蛋白與病毒復制相關部分基因序列, 構建了黃熱—乙腦嵌合病毒 (YF-JE) , 將其在Vero細胞上培養, 制備減毒活疫苗ChimeriVax TM-JE, 該疫苗對小鼠?;ば院? 且無中樞毒性;對人有較高的免疫原性, 接種成人和兒童后均能誘導機體產生高滴度的中和抗體, 并且超過90%的成人在接種疫苗5年后血清中仍有?;ば鑰固? 超過80%的兒童在初次免疫2年后血清中仍有?;ば鑰固錥18]。此外, 蚊子喂食含有高滴度的黃熱—乙腦嵌合病毒的人工血液后, 并沒有感染該病毒, 表明蚊子可能不會將病毒從一個接種疫苗的個體傳播到另一個宿主[19]。豬接種該疫苗后也沒有出現明顯的病毒血癥, 證明該疫苗在自然界中難以傳播, 毒力不易返強[20]。目前該疫苗已在澳大利亞注冊成功。

  3.4 、多表位疫苗

  多表位疫苗是基于抗原表位氨基酸序列而制備的一種新型分子疫苗, 同時攜帶多個目標抗原相關及輔助性表位的疫苗, 能夠被多種遺傳背景的MHC分子識別、結合, 從而得到高效的遞呈, 具有安全性好、?;ちη亢涂捎行У骺賾Υ鵠嘈偷扔諾?。將JEV蛋白上主要的細胞表位構建到原核表達載體中, 表達的融合蛋白純化后免疫小鼠, 能夠刺激小鼠產生特異性的細胞免疫和體液免疫應答反應, 對致死量的JEV感染具有?;ぷ饔? 這為研究安全有效的JEV提供了新的思路和方法。鐘登科等[21]以酵母菌表達的JEV E蛋白多表位肽構建了重組酵母菌株X33 (pPICZ-MP) , 并分泌表達多表位肽rMP;純化后的rMP免疫小鼠產生了較強的體液免疫和細胞免疫反應, 可?;ば∈竺饈苤濾懶縅EV的攻擊。這些研究為流行性JEV多表位疫苗的研制提供了新思路。

  3.5、 DNA疫苗

  DNA疫苗是將含有編碼目的抗原蛋白基因序列的質粒導入宿主細胞, 通過轉錄系統表達抗原蛋白, 誘導宿主產生針對該抗原蛋白的免疫應答, 從而達到免疫目的的新型基因工程疫苗。由于DNA疫苗易生產、價格低、便于儲存和運輸等特性, 已成為國內外研究的熱點。目前上市的獸用DNA疫苗主要有H5亞型禽流感DNA疫苗、馬用西尼羅河熱 (WNV) 疫苗和大西洋鮭魚傳染性造血組織壞死病毒 (IHNV) 疫苗[22]。Li等[23]將制備表達JEV E蛋白的DNA候選疫苗pCAG-JME免疫小鼠后, 能誘導小鼠產生高水平的中和抗體, 攻毒?;な匝橄允靖靡咼綞孕∈缶哂?00%?;ぷ饔?。雖然DNA疫苗在小鼠試驗中效果較好, 但免疫大動物后免疫原性較差。為了克服這一缺點, 研究人員不斷從基因優化、佐劑配方、疫苗接種方式等方面進行改進, 目前電穿孔 (EP) 傳遞方法通過瞬時電脈沖將高分子藥物遞送到細胞中, 用低劑量的DNA疫苗即可誘導強烈的免疫反應。EP作為一種有效傳遞方法, 可能在DNA疫苗接種方面具有廣闊的應用前景[24]。Ketloy等[25]在豬體內試驗2種乙腦DNA疫苗以評價其免疫原性 (2種疫苗質粒均包括JEV的前膜蛋白 (PrM) 的信號肽、前膜蛋白及外殼的編碼區域, 僅載體質粒有所不同, 分別命名為PCJEME和PNJEME) , 結果發現, 二者免疫原性無顯著差別。應用2種100~450 mg DNA疫苗 (相隔3周) 免疫豬1周后血凝抑制抗體達1∶40~1∶160, 并且能維持245 d以上, 說明這兩種DNA疫苗在較長的一段時間內均能誘導病毒特異性記憶B細胞產生抗體。DNA疫苗能夠誘導良好的體液免疫反應和較強的細胞免疫應答, 是未來疫苗重要技術發展方向之一。

  4、 JEV疫苗研發展望

  4.1、 生產工藝優化

  4.1.1、 培養工藝的提升

  目前, 國內商品化JEV疫苗均采用傳統轉瓶培養方式, 存在細胞易污染、勞動強度大等缺點。與轉瓶培養工藝相比, 反應器懸浮培養獲得的細胞密度、病毒效價、產品質量均明顯提高, 生產能耗大幅降低。熊煒等[26]將JEV SA14-14-2株接種于BHK-21細胞懸浮液中培養, 將培養的JEV毒液依次進行凍融和離心, 收集JEV抗原, 制備豬JEV疫苗。劉鈿蓮等[27]將Vero種子細胞加入300 L生物反應器中, 與微載體一起進行灌流培養5~6 d后, 沉降微載體和細胞, 以維持液替換培養基, 接種JEV繼續進行灌流培養, 收集病毒培養液, 過濾、滅活并純化。此方法提高了細胞密度, 實現大規模、高密度培養, 消除了產品批次間差異和培養周期的不穩定性, 提高了產品質量。

  4.1.2、 病毒抗原的純化

  目前, 國內商品化的豬JEV疫苗純化相對落后, 疫苗大多直接以細胞繁殖的病毒液進行成品苗的生產, 受培養基成分、細胞破碎產物和細胞代謝產物等影響, 動物免疫疫苗后易發生過敏、發熱等不良反應, 故提高病毒抗原純凈性是提升疫苗質量的基本途徑。高軍等[28]將凝膠過濾層析所獲得的病毒蛋白溶液進行陰離子交換層析, 使DNA牢固吸附在離子交換介質上而病毒蛋白穿透而過, 從而達到去除宿主DNA的目的, 提高疫苗產品質量。此外, 高軍等[29]通過中空纖維膜對病毒收獲液進行微濾處理, 有效去除殘留的DNA, 從而使成品疫苗DNA殘留量達到合格標準。丁旭娜等[30]采用了微濾澄清純化法、超濾濃縮純化法及重復洗濾法等一系列工藝, 最大限度地增大JEV的回收效率, 制備的豬JEV濃縮液成品疫苗具有純凈度高、安全性高及免疫效果好等優點。李旭等[31]應用CaptoCore700復合介質使JEV分子從凝膠表面流過, 宿主蛋白等小分子雜質被凝膠內正電荷基團吸附, 宿主蛋白去除率為64.48%~70.35%, 可將純化滅活液的上樣體積由15%柱體積提高至300%, 達到分離純化效果。

  4.1.3、 佐劑的應用

  佐劑可以是分子、化合物或大分子聚合物, 能非特異性地調節或增強抗原自身的免疫原性, 引起強烈和持久的免疫反應的物質, 在疫苗研發中有著重要的作用。劉洪明[32]將603納米、Gel01、ISA206、IMS1313佐劑和滅活的豬源基因Ⅰ型SCYA201201株細胞培養物混合制備成4種不同佐劑滅活疫苗, 在小鼠體內進行抗體消長規律、攻毒?;ぜ懊庖咝∈蠛蟮拿庖哂Υ鶚匝? 結果顯示, Gel01佐劑疫苗免疫小鼠后, 抗體水平最高, 對JEV?;ぢ?00%, 刺激小鼠體液免疫和細胞免疫應答效果最好。劉扶搖等[33]測定水性疫苗佐劑MontanideTM Gel01 ST (Gel01 ST) 稀釋豬JEV活疫苗協同免疫小鼠后的攻毒?;で榭? 結果顯示, Gel01 ST佐劑稀釋的活疫苗免疫小鼠后, 從第4天開始其血清抗體水平明顯高于無佐劑組, 且從第7天開始可對小鼠提供100%的攻毒?;ばЯ?。Gel01 ST 佐劑能很好地誘發免疫小鼠的體液免疫應答, 增強豬JEV活疫苗的早期免疫?;?。

  4.1.4 耐熱?;ぜ戀撓τ?/strong>

  在疫苗運輸過程中, 具有生物活性的制品在高溫和長時間保存的情況下, 凍干物質可能產生物理和化學變化, 從而對活疫苗質量產生影響。耐熱?;ぜ量扇繁2《駒?~8 ℃條件下保存24個月, 效價無明顯下降, 即使在37 ℃也可保存10 d以上。其?;ば閱鼙卻潮;ぜ糧帕? 使活苗的儲存、運輸和使用更方便、經濟。潘春剛等[34]研制了1種豬JEV活疫苗耐熱凍干?;ぜ? 將其與豬JEV活疫苗病毒液混合, 冷凍干燥后即得凍干疫苗。耐熱凍干?;ぜ僚浞郊虻? 制備便易, 適于大規模生產, 對疫苗具有良好的?;すπ?。巢偉等[35]研發了一種活疫苗的耐熱凍干?;ぜ? 與常規的?;ぜ料啾? 其更能有效地?;ひ咼韁脅《凈盍? 37 ℃耐熱超過20 d, 2~8 ℃能保存2年以上, 降低了疫苗對溫度保存條件的要求, 方便疫苗貯藏和冷鏈運輸。

  4.2、 新基因型疫苗研究的必要性

  近年來, JEV流行區域的不斷擴大及其流行優勢基因型的改變給JEV防控帶來了新挑戰。JEV非疫區——西藏于2009年發現JEV感染[36]。1970年前, 中國流行的JEV主要為基因Ⅲ型, 1979年在云南發現JEV基因Ⅰ型的存在, 而后JEV基因Ⅰ型逐漸成為中國流行優勢基因型[37,38,39]。目前, JEV活疫苗及滅活疫苗均屬于JEV基因Ⅲ型疫苗。研究表明, JEV基因Ⅲ型疫苗可預防JEV基因Ⅰ~Ⅳ型感染。然而, 近期研究報道, JEV基因Ⅲ型疫苗對基因Ⅰ型病毒的?;ばЧ贍艽嬖誆鉅? 使用JEV基因Ⅰ、Ⅲ型弱毒疫苗免疫豬2次發現, 不論是初次免疫還是2次免疫后, 免疫豬JEV基因Ⅰ型的中和抗體陽性率顯著低于基因Ⅲ型[40,41]。需要認真評價JEV基因Ⅰ型疫苗研究的可行性和必要性。

  1952年首次發現的JEV基因Ⅴ型毒株 (Muar株, 分離于馬來西亞) 并未流行起來, 但其在2009年同時出現于東亞 (朝鮮) 和南亞 (西藏) , 為預防和控制JEV提出了新的挑戰[42]。且JEV基因Ⅴ型和基因Ⅰ~Ⅳ型在分子生物學特性上有顯著差異, 基因Ⅲ、Ⅴ型間的交叉免疫原性差。目前JEV疫苗對基因Ⅴ型感染的?;ぷ饔梅淺S邢?(?;つ芰鑫?0%) 。目前尚不知JEV基因Ⅴ型今后的流行趨勢[43], 需要繼續進行監測。

  5、 小 結

  乙型腦炎是一種由JEV引起的人畜共患病, 開發安全有效的JEV疫苗對人類和動物健康至關重要。JEV疫苗的開發始于20世紀40年代甲醛滅活小鼠腦源疫苗, 但這些疫苗存在一定副作用, 已于2011年5月停止使用。原代細胞源疫苗在預防豬乙型腦炎的早期發揮了重要的作用, 但其批次間質量差異大, 成本高, 逐漸被細胞源疫苗所代替。隨著基因工程和蛋白質工程的發展, 以及對病毒分子結構和功能的深入研究, 一些新技術、新手段被應用到JEV疫苗研究中, 盡管科研人員在亞單位疫苗、病毒樣顆粒疫苗、嵌合病毒疫苗、多表位疫苗、DNA疫苗等方面做了很多基礎試驗研究, 但均處于實驗室研究階段, 應用到臨床仍任重道遠。研制豬JEV基因工程疫苗將成為預防豬乙型腦炎重要的發展方向。此外, 疫苗的品質提升離不開生產工藝技術的提升, 優化培養工藝、純化病毒抗原、應用佐劑和耐熱?;ぜ戀炔唄暈鞪EV疫苗品質提升提供了新的方向。相信隨著研究的進一步深入, 將會研制出更安全、更有效的疫苗防控豬乙型腦炎。

  參考文獻

  [1] CAMPBELL G L, HILLS S L, FISCHER M, et al.Estimated global incidence of Japanese encephalitis:A systematic review[J].Bull World Health Organ, 2011, 89 (10) :766-774.
  [2] SHENG Z, GAO N, CUI X, et al.Electroporation enhances protective immune response of a DNA vaccine against Japanese encephalitis in mice and pigs[J].Vaccine, 2016, 34 (47) :5751-5757.
  [3] YUN S I, LEE Y M.Japanese encephalitis the virus and vaccines[J].Human Vaccines & Immunotherapeutics, 2014, 2 (10) :263-279.
  [4] SCHIOLER K L, SAMUEL M, WAI K L.Vaccines for preventing Japanese encephalitis[J].Cochrane Database of Systematic Reviews, 2007, 3:4263.
  [5] LYONS A, KANESA-THASAN N, KUSCHNER R A, et al.A Phase 2 study of a purified, inactivated virus vaccine to prevent Japanese encephalitis[J].Vaccine, 2007, 25 (17) :3445-3453.
  [6] JELINEK T.Ixiaro:A new vaccine against Japanese encephalitis[J].Expert Review of Vaccines, 2009, 8 (11) :1501-1511.
  [7] YU Y X.Phenotypic and genotypic characteristics of Japanese encephalitis attenuated live vaccine virus SA14-14-2 and their stabilities[J].Vaccine, 2010, 28 (21) :3635-3641.
  [8] DING D, KILGORE P E, CLEMENS J D, et al.Cost-effectiveness of routine immunization to control Japanese encephalitis in Shanghai, China[J].Bull World Health Organ, 2003, 81 (5) :334-342.
  [9] ROEHRIG J T.Antigenic structure of flavivirus proteins[J].Advances in Virus Research, 2003, 59:141-175.
  [10] ZHANG F, MA W, ZHANG L, et al.Expression of particulate-form of Japanese encephalitis virus envelope protein in a stably transfected Drosophila cell line[J].Virology Journal, 2007, 4:17.
  [11] HUA R H, LI Y N, CHEN Z S, et al.Generation and characterization of a new mammalian cell line continuously expressing virus-like particles of Japanese encephalitis virus for a subunit vaccine candidate[J].BMC Biotechnol, 2014, 14:62.
  [12] 張艷芳, 杜瑞坤, 黃少梅, 等.乙型腦炎病毒樣顆粒疫苗的制備及其免疫?;ば實某醪狡蘭踇J].病毒學報, 2016, 32 (2) :150-155.ZHANG Y F, DU R K, HAUGN S M, et al.Generation of Japanese encephalitis virus-like particle vaccine and preliminary evaluation of its protective efficiency[J].Chinese Journal of Virology, 2016, 32 (2) :150-155. (in Chinese)
  [13] DE WISPELAERE M, RICKLIN M, SOUQUE P, et al.A lentiviral vector expressing Japanese encephalitis virus-like particles elicits broad neutralizing antibody response in pigs[J].PLoS Neglected Tropical Diseases, 2015, 9 (10) :e0004081.
  [14] MATSUDA S, NEROME R, MAEGAWA K, et al.Development of a Japanese encephalitis virus-like particle vaccine in silkworms using codon-optimised prM and envelope genes[J].Heliyon, 2017, 3 (4) :e00286.
  [15] FAN Y C, CHEN J M, LIN J W, et al.Genotype I of Japanese encephalitis virus virus-like particles elicit sterilizing immunity against genotype Ⅰ and Ⅲ viral challenge in swine[J].Scientific Reports, 2018, 8 (1) :7481.
  [16] PUGACHEV K V, GUIRAKHOO F, MONATH T P.New developments in flavivirus vaccines with special attention to yellow fever[J].Current Opinion in Infectious Diseases, 2005, 18 (5) :387-394.
  [17] APPAIAHGARI M B, VRATI S.IMOJEV (R) :A yellow fever virus-based novel Japanese encephalitis vaccine[J].Expertreview of Vaccines, 2010, 9 (12) :1371-1384.
  [18] CHIN R, TORRESI J.Japanese B encephalitis:An overview of the disease and use of chimerivax-JE as a preventative vaccine[J].Infectious Diseases and Therapy, 2013, 2 (2) :145-158.
  [19] GUY B, GUIRAKHOO F, BARBAN V, et al.Preclinical and clinical development of YFV 17D-based chimeric vaccines against dengue, West Nile and Japanese encephalitis viruses[J].Vaccine, 2010, 28 (3) :632-649.
  [20] CHAMBERS T J, NESTOROWICZ A, MASON P W, et al.Yellow fever/Japanese encephalitis chimeric viruses:Construction and biological properties[J].Journal of Virology, 1999, 73 (4) :3095-3101.
  [21] 鐘登科, 黃藝珠, 魏建超, 等.流行性乙型腦炎病毒E蛋白多表位肽在畢赤酵母中分泌表達及其免疫原性研究[J].中國預防獸醫學報, 2017, 33 (6) :485-489.ZHONG D K, HUAGN Y Z, WEI J C, et al.Expression of recombinant multi-epitope vaccine of Japanese encephalitis virus in Pichia pastoris and evaluation on its immunogenicity in mice model[J].Chinese Journalof Preventive Veterinary Medicine, 2017, 33 (6) :485-489. (in Chinese)
  [22] LIU M A.DNA vaccines:An historical perspective and view to the future[J].Immunological Reviews, 2011, 239 (1) :62-84.
  [23] LI J, CHEN H, WU N, et al.Characterization of immune responses induced by inactivated, live attenuated and DNA vaccines against Japanese encephalitis virus in mice[J].Vaccine, 2013, 31 (38) :4136-4142.
  [24] WEILAND O, AHLEN G, DIEPOLDER H, et al.Therapeutic DNA vaccination using in vivo electroporation followed by standard of care therapy in patients with genotype Ⅰ chronic hepatitis C[J].Molecular Therapy, 2013, 21 (9) :1796-1805.
  [25] KETLOY C, KEELAPANG P, PROMPETCHARA E, et al.Strategies to improve the immunogenicity of prM+E dengue virus type-2 DNA vaccine[J].Asian Pacific Journal of Allergy and Immunology, 2017, 35 (1) :11-19.
  [26] 熊煒, 高楊, 劉俊生, 等.豬乙腦疫苗及其制備方法[P].2014.XIONG W, GAO Y, LIU J S, et al.Swine Japanese encephalitis vaccine and preparation method[P].2014. (in Chinese)
  [27] 劉鈿蓮, 劉丹, 艾文.一種乙型腦炎疫苗的生產方法[P].2014.LIU D L, LIU D, AI W.A preparation method of Japanese encephalitis vaccine[P].2014. (in Chinese)
  [28] 高軍, 白珠穆, 李旭, 等.利用陰離子交換層析去除乙腦疫苗制品中殘留DNA的方法[P].2017.GAO J, BAI Z M, LI X, et al.Method for removing residual DNA in Japanese encephalitis vaccine product by anion exchange chromatography[P].2017. (in Chinese)
  [29] 高軍, 白珠穆, 李旭, 等.利用中空纖維膜去除人用乙型腦炎疫苗制品中殘留DNA的方法[P].2016.GAO J, BAI Z M, LI X, et al.Method for removing residual DNA in Japanese encephalitis vaccine product by hollow fiber membrane[P].2016. (in Chinese)
  [30] 丁旭娜, 吳全忠, 米娜, 等.一種豬乙型腦炎病毒純化方法[P].2017.DING X N, WU Q Z, MI N, et al.A method for purifying porcine Japanese encephalitis virus[P].2017. (in Chinese)
  [31] 李旭, 徐威, 于海, 等.乙型腦炎滅活疫苗下游純化工藝研究[J].生物化工, 2018, 4 (3) :49-52.LI X, XU W, YU H, et al.Application of capto core 700 in Japanese encephalitis vaccine purification[J].Shengwu Huagong, 2018, 4 (3) :49-52. (in Chinese)
  [32] 劉洪明.豬乙型腦炎病毒滅活疫苗佐劑篩選及免疫效果評估[D].雅安:四川農業大學, 2017.LIU H M.Effect of different adjuvants on immunogenicity of Japanese encephalitis virus inactivated vaccine[D].Ya’an:Sichuan Agricultural University, 2017. (in Chinese)
  [33] 劉扶搖, 王夢君, 李雨軒, 等.MontanideTM Gel 01 ST 水性佐劑對豬乙型腦炎活疫苗免疫小鼠后的早期免疫?;ばЧ撓跋靃J].中國預防獸醫學報, 2018, 40 (1) :40-44.LIU F Y, WANG M J, LI Y X, et al.The effect of aqueous adjuvant MontanideTM Gel 01 ST on early immune protection of swine Japanese encephalitis live-vaccine in mice[J].Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine, 2018, 40 (1) :40-44. (in Chinese)
  [34] 潘春剛, 姜國華, 郝霖雨, 等.豬乙型腦炎活疫苗耐熱凍干?;ぜ?、其制備方法及應用[P].2018.PAN C G, JIANG G H, HAO L Y, et al.Preparation method and application of heat-resistant lyophilized stabilizers for swine Japanese encephalitis live vaccine[P].2018. (in Chinese)
  [35] 巢偉, 張桂紅, 王和平, 等.活疫苗的耐熱凍干?;ぜ良捌渲票阜椒ê陀τ肹P].2016.CHAO W, ZHANG G H, WANG H P, et al.Preparation method and application of heat-resistant lyophilized stabilizers of live vaccine[P].2016. (in Chinese)
  [36] ZHANG H, REHMAN M U, LI K, et al.Epidemiologic survey of Japanese encephalitis virus infection, Tibet, China, 2015[J].Emerging Infectious Diseases, 2017, 23 (6) :1023-1024.
  [37] 張婧, 李加全, 馮云, 等.云南省保山市蚊蟲中檢測到基因Ⅰ型流行性乙型腦炎病毒[J].疾病監測, 2018, 33 (2) :150-153.ZHANG J, LI J Q, FENG Y, et al.Identification of Japanese encephalitis virus genotype Ⅰ from mosquitoes in Baoshan, Yunnan[J].Disease Surveillance, 2018, 33 (2) :150-153. (in Chinese)
  [38] 王環宇, 付士紅, 李曉宇, 等.我國首次分離到基因Ⅰ型乙型腦炎病毒[J].中華微生物學和免疫學雜志, 2004, 24 (11) :843-849.WANG H Y, FU S H, LI X Y, et al.Isolation and identification of genotype Ⅰ Japanese encephalitis virus in China[J].Chinese Journal of Microbiologyand Immunology, 2004, 24 (11) :843-849. (in Chinese)
  [39] 莫兆軍, 呂新軍, 譚毅, 等.廣西北流市分離到基因Ⅰ型流行性乙型腦炎病毒[J].疾病監測, 2010, 25 (2) :115-120.MO Z J, LYU X J, TAN Y, et al.Isolation of genotype Ⅰ Japanese encephalitis virus in Beiliu, Guangxi[J].Disease Surveillance, 2010, 25 (2) :115-120. (in Chinese)
  [40] FAN Y C, CHEN J M, CHEN Y Y, et al.Reduced neutralizing antibody titer against genotype Ⅰ virus in swine immunized with a live-attenuated genotype Ⅲ Japanese encephalitis virus vaccine[J].Veterinary Microbiology, 2013, 163 (3-4) :248-256.
  [41] 杜立中, 魏建超, 馬志永.流行性乙型腦炎流行病學新進展及面臨的挑戰[J].畜牧與獸醫, 2014, 46 (10) :116-119.DU L Z, WEI J C, MA Z Y.New progress and challenges in epidemiology of Japanese encephalitis[J].Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2014, 46 (10) :116-119. (in Chinese)
  [42] 張慧艷, 高曉艷, 崔世恒, 等.我國新出現的基因Ⅴ型乙腦病毒全基因組分子特征[J].中華微生物學和免疫學雜志, 2015, 2:81-86.ZHANG H Y, GAO X Y, CUI S H, et al.Whole genome sequence analysis of an emerging Japanese encephalitis virus (genotype V) strain isolated in mainland China[J].Chinese Journal of Microbiology and Immunology, 2015, 2:81-86. (in Chinese)
  [43] CAO L, FU S, GAO X, et al.Low protective efficacy of the current Japanese encephalitis vaccine against the emerging genotype 5 Japanese encephalitis virus[J].PLoS Neglected Tropical Diseases, 2016, 10 (5) :e0004686.

重要提示:轉載本站信息須注明來源:原創論文網,具體權責及聲明請參閱網站聲明。
閱讀提示:請自行判斷信息的真實性及觀點的正誤,本站概不負責。
我們的服務
聯系我們
相關文章